蛋白质生物学推介（五）

此篇为完结篇，往期链接：

调节蛋白通过决定GTP或GDP是否结合来控制GTP结合蛋白的活性

GTP结合蛋白由决定GTP或GDP是否结合的调节蛋白控制，就像磷酸化蛋白由蛋白激酶和蛋白磷酸酶打开和关闭一样。

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聊生信：RAS蛋白家族的突变在不同的癌症类型中经常被观察到。KRAS蛋白的突变与恶性肿瘤的起源密切相关，占这些突变绝大多数的氨基酸位置是G12、G13和Q61，其预后影响因癌症类型而异，但已被证明与结直肠癌、非小细胞肺癌和其他癌症的不良预后相关。虽然在癌症中高度复发，但用抑制剂靶向这些RAS突变体的尝试尚未成功，且被认为具有“不可成药”性（尽管最近的一款靶向药被FDA加速批准上市），但相关的抑制剂尚未成为临床上的常见疗法。

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Ras可被GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein, GAP）灭活。GAP蛋白与Ras蛋白结合，并诱导其将结合的GTP分子水解为GDP（保持紧密结合）和无机磷酸盐（Pi），后者迅速释放。Ras蛋白在遇到鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine nucleotide Exchange Factor, GEF）之前一直保持其非活性的GDP结合构象，GEF与GDP-Ras结合并使其释放GDP。由于空的核苷酸结合位点立即被GTP分子填充（细胞中GTP的含量远远超过GDP），（总的来讲）GEF通过间接地添加回去GTP（由于）水解去除的磷酸基团来激活Ras（聊生信：整体上GEF只需要“卸载”掉GDP即可。因为GTP由于本身的浓度高，很容易重新加到Ras蛋白上）。因此，在某种意义上，GAP和GEF的作用分别类似于蛋白磷酸酶和蛋白激酶。

真核细胞两种主要细胞内信号传导机制的比较
在这两种情况下，一个信号蛋白通过添加一个磷酸基团而被激活，而通过移除这个磷酸基团而失活。为了强调两种途径的相似性，我们将ATP和GTP分别画为APPP和GPPP, ADP和GDP分别画为APP和GPP。

（但）在蛋白质上加入磷酸基团后也有可能起到抑制蛋白活性的作用。

大的蛋白质移动可由小的蛋白质位移所引发

Ras蛋白属于单体GTP酶的一个大超家族，每个GTP酶由一个约200个氨基酸组成的GTP结合域组成。在进化过程中，该结构域也与具有更多附加的结构域的较大蛋白质结合，从而形成一个GTP结合蛋白质大家族。家族成员包括参与细胞信号传导的受体相关三聚体G蛋白（receptor-associated trimeric G proteins）、调节细胞内小泡间交通的蛋白，以及与tRNA结合并作为核糖体上蛋白质合成的组装因子所需的蛋白质。在每种情况下，一种重要的生物活性都是由蛋白质构象的变化控制的，这种变化是由Ras样结构域（Ras-like domain）中GTP的水解引起的。

EF-Tu蛋白为这一蛋白质家族的工作原理提供了一个很好的例子。EF-Tu是一种丰富的分子，在蛋白质合成中作为延伸因子（因此称为EF，elongation factor），将每个氨基酰基tRNA分子装载到核糖体上。tRNA分子与GTP结合形式的EF-Tu形成紧密复合物，如下图，也见蛋白质生物学推介（四）。在这个复合物中，附着在tRNA上的氨基酸被遮掩（masked）。

一个与EF-Tu结合的氨基酰tRNA分子
EF-Tu蛋白的三个区域颜色不同。这是一种细菌蛋白质；然而，在真核生物中存在一种非常相似的蛋白质，被称为EF-1。

tRNA在蛋白质合成过程中氨基酸的转移需要揭开（此）遮掩，（在核糖体上）与EF-Tu结合的GTP水解，（最终也）使tRNA离解。由于GTP水解是由tRNA与核糖体上的mRNA分子的适当匹配所触发的，因此EF-Tu作为一个组装因子，用于区分正确和错误的mRNA-tRNA配对（更多的细节见：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26829/figure/A1077/?report=objectonly）。

比较EF-Tu的GTP结合形式和GDP结合形式的三维结构（聊生信：上一篇介绍过，但这里给出了其它细节），揭示了tRNA是如何被揭开遮掩（unmasking）。在GTP → GDP + Pi反应之后，无机磷酸基团（Pi）的解离导致GTP结合位点发生零点几纳米的位移（聊生信：即几个埃米/Å），就像在Ras蛋白中发生的一样。这种微小的移动，相当于一个氢原子直径的几倍，导致构象的变化（在蛋白的Ras样结构域中）沿着α螺旋的重要部分传播（此时称为开关螺旋：switch helix）。这个开关螺旋看起来像一个门闩，粘附在分子的另一个区域的特定位置，将蛋白质保持在一个封闭的构象中。由GTP水解引发的构象变化导致开关螺旋分离，允许分离的蛋白质结构域通过大约4纳米的距离摆动并分开。最终释放了结合的tRNA分子，允许其附着的氨基酸被使用。

由GTP水解引起的EF-Tu构象变化较大

（A）与GTP结合的EF-Tu的三维结构。顶部的结构域与Ras蛋白同源，其红色的α螺旋为GTP水解后移动的开关螺旋。（B）结构域1中开关螺旋结构的变化导致结构域2和3作为一个单一单元向观察者旋转约90°，这释放了上面倒数第二张图中与该结构结合的tRNA。

你可以从这个例子中看到，细胞是如何利用一个发生在小蛋白质结构域表面的简单化学变化来创造一个（增加）约50倍大的移动的。这种类型的巨大形状变化，也构成了马达/运动蛋白（motor proteins）中发生的巨大运动的（分子）基础。

马达/运动蛋白可在细胞中产生大的运动

我们已经看到了蛋白质的构象变化在酶调节和细胞信号传导中的核心作用。我们现在讨论的蛋白质的主要功能是：移动其他分子。这些马达/运动蛋白产生负责肌肉收缩，以及细胞爬行和游动的力量（聊生信：这可能涉及很多与运动或免疫相关疾病的遗传变异）。运动蛋白也为较小规模的细胞内运动提供动力：它们有助于在有丝分裂期间将染色体移动到细胞的两端，沿着细胞内的分子轨道移动细胞器，以及在合成新的DNA分子的过程中沿着DNA链移动酶。所有这些基本过程都依赖于蛋白质及其运动部件，这些运动部件就像产生力的机器。

这些机器是怎么工作的？换句话说，蛋白质的形状变化是如何在细胞中产生定向运动的？例如，如果一种蛋白质需要沿着一条狭窄的线（如DNA分子）行走，它可以通过经历一系列构象变化来实现这一点，如下图所示。然而，没有任何东西可以驱动这些有序的变化，它们是完全可逆的，蛋白质可以沿着线随机来回移动。我们可以用另一种方式来看待这种情况。由于蛋白质的定向运动确实起作用，热力学定律要求这种运动利用来自其他来源的自由能（否则蛋白质可以用来制造永动机）。因此，如果没有能量输入，蛋白质分子只能漫无目的地游荡。

变构“行走”蛋白。尽管它的三种不同的结构使它在被线或丝束缚时可以随意地来回移动，但这种蛋白质不能在单一方向上均匀移动。

那么怎样才能使这一系列的构象变化是单向的呢？要迫使整个循环朝着一个方向进行，就足以使任何一种形状的变化不可逆转。对于大多数能够沿一个方向长距离行走的蛋白质来说，这是通过将构象变化之一，与结合在蛋白质上的ATP分子的水解相偶联来实现的。其机制与刚才讨论的通过GTP水解导致变构蛋白形状改变的机制相似。因为当ATP（或GTP）被水解时，会释放大量的自由能，核苷酸结合（nucleotide-binding）蛋白非常不可能发生反向移动所需的形状变化，因为这也需要通过添加一个磷酸分子到ADP上（形成ATP）来逆转ATP水解。

在下图所示的模型中，ATP的结合将一个马达/运动蛋白从构象1转换到构象2。结合的ATP随后被水解生成ADP和无机磷酸盐（Pi），导致构象2转变为构象3（聊生信：此时似乎并未立即产生位移，但具备了产生位移的“力矩”）。最后，结合的ADP和Pi的释放使蛋白质回到构象1。

变构运动蛋白

三种不同构象之间的转变包括一个由结合的ATP分子水解驱动的步骤，这使得整个循环基本上是不可逆的。通过重复的循环，蛋白质沿着丝线不断地向右移动

由于（构象）2→3的转变是由ATP水解提供的能量驱动的，这一系列构象变化实际上是不可逆的。因此，整个循环只朝一个方向进行，导致蛋白质分子在这个例子中不断向右移动。

许多马达/运动蛋白以这种大致的方式产生定向运动，包括肌肉运动蛋白——myosin蛋白（肌球蛋白），它沿着肌动蛋白丝行走以产生肌肉收缩；以及沿着微管行走的kinesin蛋白（驱动蛋白）。这些运动可以是快速的：一些参与DNA复制的马达/运行蛋白（DNA解旋酶，DNA helicases）推动自己沿着一条DNA链的速度高达每秒1000个核苷酸。

膜结合的转运蛋白利用能量穿过膜来泵送分子

到目前为止，我们已经看到变构蛋白如何像微芯片一样处理信息（Cdk和Src激酶），作为组装因子(EF-Tu)，以及作为机械力和运动的发生器（马达/运动蛋白）。变构蛋白还可以利用ATP水解、离子梯度或电子传输过程产生的能量，将特定的离子或小分子泵过膜。我们在这里考虑一个例子。

人们最了解的泵蛋白之一是来自肌肉细胞的钙转运蛋白。这种被称为Ca2+泵的蛋白质，嵌在肌细胞中一种叫做肌浆网的特殊细胞器的膜中。Ca2+泵（也称为Ca2+ ATP酶）通过将钙从细胞质中泵入膜包裹的肌浆网，来维持静息肌的低细胞质钙浓度；然后，作为对神经冲动的反应，Ca2+迅速释放（通过其他通道）回到细胞质中，触发肌肉收缩。Ca2+泵与维持质膜上Na+和K+浓度差异的Na+/K+泵同源，两者都是P型阳离子泵家族的成员，因此得名（因为这些蛋白质在其反应周期中是自磷酸化的）。一个大的（朝向）细胞质的头部区域结合并水解ATP，释放磷酸盐（基团）后，形成共价键。因此，该蛋白质瞬间转变为高能磷酸化状态，与从胞浆中获取的两个Ca2+离子紧密结合。这种形式的蛋白质随后衰变为低能磷酸化状态，导致Ca2+离子释放到管腔中。酶的去磷酸化最终释放磷酸盐，并重置蛋白质，以进行下一轮离子泵。

所有P型阳离子泵的头部区域与一系列十个跨膜α螺旋相连，其中四个形成Ca2+泵的跨膜Ca2+结合位点。该蛋白质的三维结构已通过高分辨率电子显微镜和x射线衍射进行了破译（如下图）。这使得生物学家能够根据其正常和突变形式的大量生化数据推导出泵作用的分子模型。

肌浆网Ca2+泵运动Ca2+的模型+

未磷酸化钙结合态（左）的结构基于泵的X射线晶体结构。磷酸化无钙态（右）的结构基于电子显微镜确定的低分辨率结构，因此跨膜螺旋的排列是推测性的。螺旋4和6在未磷酸化状态下被破坏，并在膜的胞质侧形成Ca2+结合位点。ATP结合和水解引起剧烈的构象变化，使核苷酸结合（N）和磷酸化（P）域非常接近。这种变化被认为会导致致动器区域（a）旋转90°，从而导致跨膜螺旋的重新排列（聊生信：A似乎用loop来连接跨膜的螺旋）。这种重新排列消除了螺旋4和螺旋6中的断裂（breaks），消除了Ca2+结合位点，并将膜另一侧的Ca2+离子释放到肌浆网的内腔中

如下图所示，结合Ca2+的跨膜α螺旋相互缠绕，并在螺旋之间形成Ca2+空腔。ATP水解在细胞质头部产生一系列主要的构象变化，通过其柄与跨膜螺旋的连接改变膜中一些螺旋的结构和相对方向，从而改变空腔，使Ca2+离子单向穿过膜（下图B）。对于马达蛋白，离子的单向运输需要循环使用能量，从而使蛋白质的构象变化具有其偏爱（preferred）的方向性。

通过Ca2+泵输送钙离子

（A）泵蛋白的结构，由994个氨基酸组成的单个亚基组成（本文上面倒数第二张图是细节）。（B）离子泵模型。为简单起见，只显示了四个结合Ca2+的跨膜α螺旋中的两个。

人类（社会）已经发明了许多不同类型的机械泵，细胞中也含有以其他方式工作的膜结合泵也就不足为奇了。最值得注意的是旋转泵，它将ATP的水解与H+离子（质子）的运输耦合起来。这些泵类似于微型涡轮机，用于酸化溶酶体和其他真核细胞器的内部。像其他产生离子梯度的离子泵一样，如果有一个足够陡峭的梯度穿过它们传输的离子膜，它们可以反过来催化ADP+Pi → ATP的反应。

有一个这样的泵，ATP合成酶，利用电子传输过程产生的质子浓度梯度来产生现实世界（the living world）中使用的大部分ATP。这种无处不在的泵在能量转换中起着重要作用（聊生信：感兴趣的可以在其它资料中查阅其三维结构和机理）。

蛋白质通常形成大的复合物，起蛋白质机器的作用

随着人们从小的、单结构域的蛋白质发展到由多个结构域形成的大蛋白质，蛋白质所能发挥的功能变得更加复杂。然而，最令人印象深刻的任务是由许多蛋白质分子形成的大型蛋白质组装体完成的（聊生信：例如过去一年国内浙江大学参与的多篇CNS文章）。现在可以在实验室中重建无细胞系统中的大多数生物过程，很明显，细胞中的每个核心过程，如DNA复制、蛋白质合成、囊泡出芽或跨膜信号，都是由一组高度协调、连接的十个或更多蛋白质催化的。

在大多数这样的蛋白质机器中，结合的核苷三磷酸（ATP或GTP）的水解在一些单独的蛋白质亚单位中驱动一系列有序的构象变化，使得蛋白质整体能够协调地移动。通过这种方式，每一种适当的酶都可以直接放置到需要它们进行连续反应的位置。例如，在核糖体上的蛋白质合成或DNA复制中，一个大的多蛋白复合物沿着DNA快速移动，都会发生这种情况。细胞进化出蛋白质机器的原因与人类发明机械和电子机器的原因相同。

对于完成几乎任何任务，通过链接的过程（linked processes），在空间和时间上进行协调的操作比顺序使用单个工具更有效。

蛋白质相互作用的复杂网络是细胞功能的基础

在这个全基因组序列已知的“后基因组”时代，细胞生物学家面临着许多挑战。一个是需要解剖和重建存在于像我们这样的有机体中的数千个蛋白质机器中的每一个。为了了解这些非凡的蛋白质复合物，每一个都必须由其纯化的蛋白质部分重新组合而成，以便在试管中不受其他细胞成分影响的可控条件下研究其详细运行模式（mode of operation）。仅这一项任务就十分艰巨。但我们现在知道，细胞中的每一个子成分也会与其他大分子相互作用，在整个细胞中形成一个巨大的蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用网络。因此，要理解细胞，还需要分析大多数其他的相互作用。

细胞内蛋白质网络的复杂性，例如在酿酒酵母中，许多蛋白质与肌动蛋白细胞骨架（actin cytoskeleton）相互作用：

肌动蛋白在十字路口 在所有真核细胞中，肌动蛋白都能与大量的附属蛋白结合。这张图显示了大多数已经被证明的相互作用，使用遗传或生化技术，在酵母酿酒酵母。在细胞内相同过程中起作用的附属蛋白以同样的颜色显示，如KEY中所示。

这种蛋白质-蛋白质相互作用的程度也可以更普遍地估计。特别是，使用（酵母）双杂交筛选方法（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26820/figure/A1610/?report=objectonly），已经进行了大规模的努力来检测这些相互作用。因此，例如，这种方法正被应用于酿酒酵母产生的6000个基因产物的大集合。正如预期的那样，大多数已经观察到的相互作用是在相同功能组的蛋白质之间。也就是说，参与细胞周期控制的蛋白质倾向于广泛地相互作用，就像参与DNA合成或DNA修复等的蛋白质一样。但不同功能组（different functional groups ）的蛋白质成员之间也有数量惊人的相互作用（如下图）。这些相互作用可能对协调细胞功能很重要，但其中大多数还不为人所知。

在酵母S. cerevisiae中观察到的蛋白质不同功能组之间的蛋白质-蛋白质相互作用图（聊生信：未获取到更清晰的图）。

为了绘制这张图，1500多个蛋白质被分配到31个功能组（functional groups ）中。大约70%的已知蛋白质-蛋白质相互作用被观察到发生在被分配到相同功能组的蛋白质之间。然而，正如所指出的，这些组之间的交互数量惊人地多。图中的每条线都表明，在由该线连接的两个功能组中的蛋白质之间，观察到超过15种蛋白质相互作用。用黄色标记的三个功能组显示了至少15个与研究中定义的31个功能组中的10个或更多的交互作用。

对现有数据范围的研究表明，人类细胞中的平均蛋白质可能与5到15个不同的伙伴/伴侣（partners）相互作用。通常，一组不同的伙伴/伴侣会被多结构域蛋白质的每个不同结构域所结合。事实上，人们可以推测，在人类蛋白质中观察到的异常广泛的多域结构可能已经进化到产生这些相互作用。考虑到细胞中大分子相互作用网络的巨大复杂性，破译它们的全部功能可能会让科学家们忙上几个世纪（聊生信：看来未来几个世纪都是生命科学的世纪^_^!!!）。

总结

蛋白质可以形成极其复杂的化学装置，其功能在很大程度上取决于其表面的详细化学性质。配体的结合位点形成表面空腔，在这些空腔中，精确定位的氨基酸侧链通过蛋白质折叠聚集在一起。以同样的方式，通常不反应的氨基酸侧链可以被激活，以形成和破坏共价键。

酶是一种催化蛋白，通过结合特定反应路径的高能量过渡态，大大加快反应速度；它们也可同时进行酸催化和碱催化。酶反应的速度往往如此之快，以致于它们仅受扩散的限制；如果按顺序作用于底物的酶结合成一个单一的多酶复合物，或者如果酶和它们的底物被限制在细胞的同一腔内，速率可以进一步提高。

当配体与蛋白质表面结合时，蛋白质会可逆地改变其形状。一个配体产生的蛋白质构象变构变化会影响另一个配体的结合，而两个配体结合位点之间的这种连接为调节细胞过程提供了重要的机制。例如，代谢途径是由反馈调节控制的：一些小分子抑制（了）酶，另一些小分子在（反应）途径的早期激活酶。以这种方式控制的酶通常形成对称的组装，允许协同构象变化，从而对调控它们的配体浓度的变化产生急剧的反应。

蛋白质形状的变化可以由化学能的消耗以单向的方式驱动。例如，通过将变构形状的变化与ATP水解结合起来，蛋白质可以做有用的工作，如产生机械力或在单一方向上长距离移动。由X射线晶体学确定的蛋白质的三维结构，揭示了核苷三磷酸水解引起的局部微小变化是如何被放大的（从而在蛋白质的其他地方产生重大变化）。通过这种方式，这些蛋白质可以作为信息的输入输出装置，如组装因子、马达或膜结合泵。高效的蛋白质机器是通过将许多不同的蛋白质分子合并成更大的组合而形成的，在这个组合中，单个组分的变构运动是协调的。目前已知，这种机器可以在细胞中执行许多极重要的反应。

”此系列文章已完结！”

撰写：宋红卫

校对：叶明皓

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